本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜測定桑白皮中綠 原 酸 的 含 量，旨在為桑白皮的質(zhì)量控制提供方法，為今后進(jìn)一步的開發(fā)與研究提供科學(xué)依據(jù)。
1儀器和試藥
Agilent1100高 效 液 相 色 譜 儀(美 國 安 捷 倫 公司) ;KQ-200VDB型超聲波清洗器;LG16-WA型臺式 高 速 離 心 機(jī);SH2-D循環(huán)水式真空泵;綠 原 酸 對 照 品，甲 醇 為 色 譜 純(FisherScientific公 司) ，水為高純水，其余試 劑 為 分 析 純，桑 白 皮 飲 片(批 號20090907，20100525，20100128，20101026，20100705)。
2方法與結(jié)果
2.1色 譜 條 件
DiamonsilC18色 譜 柱(4.6mm×250mm，5μm) ;流動(dòng)相乙腈-0.4%磷 酸(11∶89) ;檢測波長327nm;柱 溫30°C;流 速1mL·min－1;進(jìn) 樣量10μL。見圖1。
2供試品溶液提取方法優(yōu)化
2.2.1星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)
根據(jù) 預(yù) 試 驗(yàn) 結(jié) 果，采 用 星 點(diǎn)設(shè)計(jì)法對桑白皮供試品溶液的甲醇超聲提取方法進(jìn)行優(yōu)化，以綠 原 酸 的 含 量 為 評 價(jià) 指 標(biāo)，選 擇 甲 醇 體 積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí) 間、溶 媒 比3個(gè) 因 素。星點(diǎn) 設(shè) 計(jì) 實(shí) 驗(yàn) 因素按矩陣選擇的各水平及其對應(yīng)的編碼值見表1～2。
2.2.2模型 擬 合
以 綠 原 酸 含 量 為 因 變 量，對 實(shí) 驗(yàn)結(jié)果 進(jìn) 行 二 項(xiàng) 式 擬 合，以 方 程 各 項(xiàng) 系 數(shù)P＜0.05作為顯著標(biāo)準(zhǔn)，對方程進(jìn)行優(yōu)化，得二項(xiàng)式方程:Y=0.32762+0.015799X1+0.020272X3－0.03351X12－0.01597X22－0.03008X23+0.01489X1X2+0.021596X2X3(r=0.8901)
2.2.3提取條 件 優(yōu) 化 和 驗(yàn) 證
根據(jù)二項(xiàng)式方程繪制 響 應(yīng) 曲 面 圖，結(jié) 果 見 圖2。對 二 項(xiàng) 式 方 程 進(jìn) 行 求導(dǎo)，可 得:當(dāng)提 取 條 件 為60.7%甲 醇、提 取 時(shí) 間 為45.5min，溶 媒 比 為11.6倍 時(shí)，Y有 預(yù) 測 的 zui 大值0.335。本實(shí)驗(yàn)zui終選取桑白皮的*提取條件為60%甲 醇、提 取 時(shí) 間 為15min，溶 媒 比為10倍。取桑白皮飲片粉末約5g，精密稱定，共 取3份，根 據(jù) 確定的*提取 條 件 制 備 供 試品 溶 液，按2.1項(xiàng) 下 色譜條件 進(jìn) 行 測 定。結(jié)果綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.365±0.0079mg·g－1。結(jié)果表明，本法的提取效果較好。
2.3溶液制備
2.3.1供試品 溶 液 的 制 備
取 藥 材 粉 末5.0g，精密稱 定，加60%甲 醇50mL，稱 重，超 聲45min，放冷，補(bǔ)足 質(zhì)量，濾 過，取 續(xù) 濾 液，用0.45μm濾 膜 濾過，即得。
2.3.2對照品溶液的制備
取綠原酸對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1mL含 綠 原 酸45μg對照品溶液，用0.45μm濾膜濾過，即得。
2.4線性關(guān)系 的 考 察
分 別 精 密 吸 取 對 照 品 溶 液1，2，4，6，8，10μL，注入液相色譜儀，按 上 述 色 譜 條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對 照 品 量X(μg)為橫 坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得綠原酸的回歸方程Y=2329.0289X+8.1841(r=0.9999)。綠 原酸在0.045～0.45μg，峰 面 積 與 進(jìn) 樣 量 呈 良好 的 線性關(guān)系。
2.5精密度試驗(yàn)
精密吸取對 照 品 溶 液，重 復(fù) 進(jìn) 樣6次，按2.1項(xiàng)下色 譜 條 件 進(jìn) 行 分 析，測 定 綠 原 酸峰面積。結(jié)果綠原酸峰 面 積RSD0.57%，表 明 該 方 法精密度良好。
2.6穩(wěn)定 性 試 驗(yàn)
精 密 吸 取 供 試 品 溶 液，分 別 于0，4，8，12，16，24h進(jìn) 樣10μL，按2.1項(xiàng) 下 色 譜條件 進(jìn) 行 分 析，測 定 綠 原 酸 的 峰 面 積。結(jié) 果 綠 原 酸 峰面 積RSD1.26%，表 明 供 試品 溶 液 在24h內(nèi)穩(wěn) 定。
2.7重復(fù)性試驗(yàn)
取同 一 批 樣 品6份，按2.3.1項(xiàng)下制備供試品溶液，依2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測定綠原酸的峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果桑白皮中綠原 酸 的 平 均 質(zhì) 量 分 數(shù) 為0.402mg·g－1，RSD2.02%，表明該方法的重復(fù)性良好。
2.8加樣回收率試驗(yàn)
取已測 知 含 量 的 樣 品6份，每份2.5g，精密 稱 定，分別精密加入綠原酸對照品溶液(0.45g·L－1)2mL，按 供 試 品 溶 液 的 制 備 方 法制備，進(jìn) 樣10μL，記 錄 色 譜 圖，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。
2.9樣 品 測 定
按2.3.1項(xiàng) 供 試 品 溶 液 的 制 備 方法，2.1項(xiàng) 下 的 色 譜 條 件 對5批 桑 白 皮 飲 片 進(jìn)行 測定，結(jié)果見表4。
3討論
在預(yù)試驗(yàn)中，供試品溶液的制備方法考察了超聲提取和回流 提 取2種 方 法，結(jié)果超聲提取含量較高，處理過程較簡便，所以本實(shí)驗(yàn)選 擇 超 聲 提 取 為 供試品溶液的制備方法。
星點(diǎn)設(shè)計(jì)是多因素五水平的優(yōu)化方法，先利用二項(xiàng)式非線性回歸進(jìn)行分析和計(jì)算，得到應(yīng)變量和自變量之間的函數(shù)關(guān)系，再利用此函數(shù)關(guān)系來求出*的自變量值。所以，相 對 于 正 交 設(shè)計(jì)，星 點(diǎn) 設(shè) 計(jì)-響 應(yīng)面優(yōu)化法能更準(zhǔn)備地找到所考察因素的*條件，且在zui低 要 求 下，只 是比 正 交 設(shè) 計(jì) 多6個(gè) 實(shí) 驗(yàn) 號。因此，本實(shí)驗(yàn) 采 用 星 點(diǎn) 設(shè) 計(jì)-響 應(yīng) 面 優(yōu) 化 法 對 提 取 條件進(jìn)行優(yōu)化，該方法有的統(tǒng)計(jì)軟件可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)矩陣和處理數(shù) 據(jù)，操 作 方 便，結(jié) 果 能 比較 精 確 地 找 到 各考察因素在較佳條件下因變量的zui大值。
在線咨詢